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1 主题内容与适用范围
本标准规定了对按照GB 9596.1肉与肉制品游离脂肪含量的测定得到的脂类制备脂肪甲酯的方法以及脂肪酸甲酯混合物成分用气相色谱进行定性定量测定的方法。
本标准适用于肉和肉制品中脂肪酸的测定。
本标准不适用于测定聚合的脂肪酸。
2 引用标准
GB 9695.1 肉与肉制品 游离脂肪含量的测定。
3 原理
按GB 9695.1从肉和肉制品中提取脂类，并在三氟化硼存在下，进行甘油脂的皂化和游离脂肪酸的酯化，然后进气相色谱仪，用面积归一化法测其组成。
4 试剂
所用水为蒸馏水或相当纯度的水。
4．1 氢氧化钠(GB 629)甲醇(GB 683)溶液：0.5mol。
将2g氢氧化钠溶于100mL含水不超过0.5%(m/m)的甲醇中。溶液放置一段时间后，可能产生少量碳酸钠白色沉淀而失效。此时重新配制。
4．2 三氟化硼(进口分装)甲醇(GB 683)溶液：12%~15%(m/m)。
4．3 庚烷(进口分装)：色谱纯。
4．4 石油醚(HG 3-1003)：重蒸馏的，沸程40~60℃。溴值小于1，无残渣。或已烷(进口分装)。
4．5 无水硫酸钠(HG 3-123)。
4．6 氯化钠(GB 1266)：饱和溶液。
4．7 氮气：完全干燥，纯度不小于99.99%。
4．8 氢气：纯度不小于99.9%，无杂质。
4．9 空气或氧气：无杂质。
4．10 参照标准物
与被测定的脂肪酸甲酯相同的脂肪酸甲酯标准物质的混合物。
注：①各种试剂和溶液在进行色谱分析时不得产生干扰脂肪酸甲酯峰的信号。在其色谱分析中，特别是三氟化硼甲醇溶液，可能在色谱图的20~22碳脂肪酸区域内产生干扰峰。因此每批新试剂或溶剂都应用制备纯油酸甲酯，并进行色谱分析。若有干扰峰出现，该试剂应弃之。
②若不存在含有20多或更多碳原子脂肪酸，已烷可代替庚烷。
5 装置和仪器
5．1 实验室常规仪器
5．2 滕州华普气相色谱仪HP-2013配备FID检测器。
5．3 微处理机或积分仪。
6 试样
按GB 9695.1的规定，得到的脂肪。
7 分析步骤
7．1 脂肪酸甲酯的制备
三氟化硼有毒，下列操作请在通风橱里进行，玻璃仪器用后，应立即用水冲洗。
7．1．1 试样称取
称取脂肪约350mg。根据称取脂肪量的多少按下表选择烧瓶及试剂。
脂肪量 烧瓶 氢氧化钠甲醇溶液 三氟化硼甲醇溶液 庚烷
mg mL
100~250 50 4 5 1~3
250~500 50 6 7 2~5
500~750 100 8 9 4~8
750~1000 100 10 12 7~10
7．1．2 皂化
将样品置于烧杯中，加入适量氢氧化钠甲醇溶液及助沸剂。然后将冷凝管固定于烧瓶上。
水浴上回流，至没有脂肪滴下，通常需5~10min。用移液管从冷凝管上部加入适量的三氟化硼甲醇溶液于沸腾的溶液里。
注：在含两个以上双键的脂肪酸存在时，排掉甲醇溶液和烧瓶中的空气，可向溶液中导入氨气数分钟，皂化时从冷凝管上部持续通入氮气。
7．1．3 甲酯化
7．1．3．1 接7.1.2继续煮沸2min。
7．1．3．2 经冷凝管上部加入适量的庚烷，继续煮沸1min。
停止加热，冷却至室温后，移去冷凝管。加入少量饱和氯化钠溶液并轻摇烧瓶数次。
继续加入饱和氯化钠溶液至烧瓶颈部。
7．1．3．3 吸取上层庚烷溶液约1mL于试管中，加适量无水硫酸钠脱水。
此溶液含脂肪酸甲酯约100mg/mL，可直接取一定量注入气相色谱仪测定。
7．1．4 脂肪酸甲酯的贮存
7．1．4．1 制备样品应尽快分析。不能尽快分析时，脂肪酸甲酯的庚烷溶液短期可贮存于有惰性气体的冰箱中，不适合较长时间的贮存。
7．1．4．2 不含溶剂的干燥甲酯应立即予以分析。不能分析时，应用惰性气体封存于冰箱内保存24h；或装在真空密封管里，在冰箱内可保存更长时间。
7．2 色谱条件
7．2．1 选择色谱分离条件的原则(对硬脂酸甲酯)。(附录A)
a.理论塔板数不少于2000；
b.分辨率不小于1.25；
c.出峰时间小时15min。
7．2．2 色谱性：柱长1~3m，柱内径2~4mm。
7．2．3 填充剂
7．2．3．1 担体：酸洗硅烷化的硅藻土或其他合适的惰性担体，其粒度分布均匀，大约在80~100目间。
7．2．3．2 固定相：聚酯型的极性液体(如二甘醇聚丁二酸酯、丁二醇聚丁二酸酯、乙二酸聚乙二酸酯等)、氰基硅酮或其他在气相色谱中作分离用的固定相。固定相占填充的5%~20%。
7．2．4 柱温：170℃℃
7．2．5 进样口温度：比柱温高20~50℃。
7．2．6 检则器温度：比柱温高20~50℃。
7．2．7 载气流速：15~60mL/min。
7．2．8 进样量：0.4~0.5μL。
7．3 定性分析
面积归一化法。
8 分析结果的计算
8．1 一般计算
成分i含量由下式计算：
………………………………1()
式中：Ci——成分i的质量百分比：%；
Ai——成分i的的峰面积；
——全部峰面积之和。
一般情况下，根据面积百分比计算的结果可以代表质量百分比。对于某些要求定量准确度高的测定，见8.2。
8．2 校正因子计算法
脂肪酸定量准确度要求很高时，采用校正因子法，将面积百分比换算为质量百分比。
8．2．1 校正因子
校正因子测定，是在与样品测定相同的操作条件下进行参照标准物的测定，由得到的色谱图计算。校正因子Ki按下式计算：
…………………………(2)
式中：Ki——组分i的校正因子；
mi——参照标准混合物中成分i的质量；
——参照标准混合物中各种成分的质量总和；
Ai——参照标准混合物中成分i的峰面积；
——参照标准混合物中各种成分峰面积之和。
8．2．2 相对校正因子
相对校正因子Ki’由下式给出：
…………………………(3)
式中：Ki’——相对校正因子；
Kc16——软脂酸甲酯的校正因子；
Ki——组分i的校正因子。
8．2．3 含量计算
样品中成分i的含量按下式计算：
……………………(4)
式中：C’i——校正后成分i的质量百分比，%；
A’i——校正后成分i的峰面积；
——校正后样品中各种成分峰面积之和。
8．3 计算结果保留小数点后一位。
附加说明：
本标准由商业部食品局提出。
本标准由中国肉类食品综合研究中心归口。
本标准由中国肉类食品综合研究中心负责起草。
关键词：肉与肉制品 脂肪酸检测本标准规定了对按照GB 9596.1肉与肉制品游离脂肪含量的测定得到的脂类制备脂肪甲酯的方法以及脂肪酸甲酯混合物成分用气相色谱进行定性定量测定的方法。
本标准适用于肉和肉制品中脂肪酸的测定。
本标准不适用于测定聚合的脂肪酸。
2 引用标准
GB 9695.1 肉与肉制品 游离脂肪含量的测定。
3 原理
按GB 9695.1从肉和肉制品中提取脂类，并在三氟化硼存在下，进行甘油脂的皂化和游离脂肪酸的酯化，然后进气相色谱仪，用面积归一化法测其组成。
4 试剂
所用水为蒸馏水或相当纯度的水。
4．1 氢氧化钠(GB 629)甲醇(GB 683)溶液：0.5mol。
将2g氢氧化钠溶于100mL含水不超过0.5%(m/m)的甲醇中。溶液放置一段时间后，可能产生少量碳酸钠白色沉淀而失效。此时重新配制。
4．2 三氟化硼(进口分装)甲醇(GB 683)溶液：12%~15%(m/m)。
4．3 庚烷(进口分装)：色谱纯。
4．4 石油醚(HG 3-1003)：重蒸馏的，沸程40~60℃。溴值小于1，无残渣。或已烷(进口分装)。
4．5 无水硫酸钠(HG 3-123)。
4．6 氯化钠(GB 1266)：饱和溶液。
4．7 氮气：完全干燥，纯度不小于99.99%。
4．8 氢气：纯度不小于99.9%，无杂质。
4．9 空气或氧气：无杂质。
4．10 参照标准物
与被测定的脂肪酸甲酯相同的脂肪酸甲酯标准物质的混合物。
注：①各种试剂和溶液在进行色谱分析时不得产生干扰脂肪酸甲酯峰的信号。在其色谱分析中，特别是三氟化硼甲醇溶液，可能在色谱图的20~22碳脂肪酸区域内产生干扰峰。因此每批新试剂或溶剂都应用制备纯油酸甲酯，并进行色谱分析。若有干扰峰出现，该试剂应弃之。
②若不存在含有20多或更多碳原子脂肪酸，已烷可代替庚烷。
5 装置和仪器
5．1 实验室常规仪器
5．2 滕州华普气相色谱仪HP-2013配备FID检测器。
5．3 微处理机或积分仪。
6 试样
按GB 9695.1的规定，得到的脂肪。
7 分析步骤
7．1 脂肪酸甲酯的制备
三氟化硼有毒，下列操作请在通风橱里进行，玻璃仪器用后，应立即用水冲洗。
7．1．1 试样称取
称取脂肪约350mg。根据称取脂肪量的多少按下表选择烧瓶及试剂。
脂肪量 烧瓶 氢氧化钠甲醇溶液 三氟化硼甲醇溶液 庚烷
mg mL
100~250 50 4 5 1~3
250~500 50 6 7 2~5
500~750 100 8 9 4~8
750~1000 100 10 12 7~10
7．1．2 皂化
将样品置于烧杯中，加入适量氢氧化钠甲醇溶液及助沸剂。然后将冷凝管固定于烧瓶上。
水浴上回流，至没有脂肪滴下，通常需5~10min。用移液管从冷凝管上部加入适量的三氟化硼甲醇溶液于沸腾的溶液里。
注：在含两个以上双键的脂肪酸存在时，排掉甲醇溶液和烧瓶中的空气，可向溶液中导入氨气数分钟，皂化时从冷凝管上部持续通入氮气。
7．1．3 甲酯化
7．1．3．1 接7.1.2继续煮沸2min。
7．1．3．2 经冷凝管上部加入适量的庚烷，继续煮沸1min。
停止加热，冷却至室温后，移去冷凝管。加入少量饱和氯化钠溶液并轻摇烧瓶数次。
继续加入饱和氯化钠溶液至烧瓶颈部。
7．1．3．3 吸取上层庚烷溶液约1mL于试管中，加适量无水硫酸钠脱水。
此溶液含脂肪酸甲酯约100mg/mL，可直接取一定量注入气相色谱仪测定。
7．1．4 脂肪酸甲酯的贮存
7．1．4．1 制备样品应尽快分析。不能尽快分析时，脂肪酸甲酯的庚烷溶液短期可贮存于有惰性气体的冰箱中，不适合较长时间的贮存。
7．1．4．2 不含溶剂的干燥甲酯应立即予以分析。不能分析时，应用惰性气体封存于冰箱内保存24h；或装在真空密封管里，在冰箱内可保存更长时间。
7．2 色谱条件
7．2．1 选择色谱分离条件的原则(对硬脂酸甲酯)。(附录A)
a.理论塔板数不少于2000；
b.分辨率不小于1.25；
c.出峰时间小时15min。
7．2．2 色谱性：柱长1~3m，柱内径2~4mm。
7．2．3 填充剂
7．2．3．1 担体：酸洗硅烷化的硅藻土或其他合适的惰性担体，其粒度分布均匀，大约在80~100目间。
7．2．3．2 固定相：聚酯型的极性液体(如二甘醇聚丁二酸酯、丁二醇聚丁二酸酯、乙二酸聚乙二酸酯等)、氰基硅酮或其他在气相色谱中作分离用的固定相。固定相占填充的5%~20%。
7．2．4 柱温：170℃℃
7．2．5 进样口温度：比柱温高20~50℃。
7．2．6 检则器温度：比柱温高20~50℃。
7．2．7 载气流速：15~60mL/min。
7．2．8 进样量：0.4~0.5μL。
7．3 定性分析
面积归一化法。
8 分析结果的计算
8．1 一般计算
成分i含量由下式计算：
………………………………1()
式中：Ci——成分i的质量百分比：%；
Ai——成分i的的峰面积；
——全部峰面积之和。
一般情况下，根据面积百分比计算的结果可以代表质量百分比。对于某些要求定量准确度高的测定，见8.2。
8．2 校正因子计算法
脂肪酸定量准确度要求很高时，采用校正因子法，将面积百分比换算为质量百分比。
8．2．1 校正因子
校正因子测定，是在与样品测定相同的操作条件下进行参照标准物的测定，由得到的色谱图计算。校正因子Ki按下式计算：
…………………………(2)
式中：Ki——组分i的校正因子；
mi——参照标准混合物中成分i的质量；
——参照标准混合物中各种成分的质量总和；
Ai——参照标准混合物中成分i的峰面积；
——参照标准混合物中各种成分峰面积之和。
8．2．2 相对校正因子
相对校正因子Ki’由下式给出：
…………………………(3)
式中：Ki’——相对校正因子；
Kc16——软脂酸甲酯的校正因子；
Ki——组分i的校正因子。
8．2．3 含量计算
样品中成分i的含量按下式计算：
……………………(4)
式中：C’i——校正后成分i的质量百分比，%；
A’i——校正后成分i的峰面积；
——校正后样品中各种成分峰面积之和。
8．3 计算结果保留小数点后一位。
附加说明：
本标准由商业部食品局提出。
本标准由中国肉类食品综合研究中心归口。
本标准由中国肉类食品综合研究中心负责起草。